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目前，細(xì)菌鞭毛染色方法根據(jù)染色劑的不同，可分為堿性復(fù)紅法、副品紅法、結(jié)晶紫法、維多利亞藍(lán)B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩(wěn)定的膠體溶液做媒染劑，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進(jìn)一步染色后即可在油鏡下觀察。

1. 堿性復(fù)紅法和副品紅法

1926年由Gray首創(chuàng)，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性復(fù)紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾后方可使用。染片時(shí)，媒染劑染色約6min，具體時(shí)間尚需在試驗(yàn)中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復(fù)紅染液，染片時(shí)需要1小片吸水紙蓋在涂片上，染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。Leifson于1930年建立了副品紅法，并于1938年和1951年兩次對(duì)該方法進(jìn)行了改良，稱為L(zhǎng)eifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用時(shí)把等體積A和B混合，然后再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個(gè)月。

2. 結(jié)晶紫法，又稱Ryu法

1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進(jìn)行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結(jié)晶紫乙醇溶液，即12g結(jié)晶紫溶于100 ml無(wú)水乙醇中。使用時(shí)把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術(shù)進(jìn)行鞭毛染色，雖然可以觀察到細(xì)菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優(yōu)點(diǎn)是試劑比較穩(wěn)定，目前Difco公司已經(jīng)研制出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.

3. 維多利亞藍(lán)B法

1990年由Inoue等報(bào)道日本制藥株式會(huì)社Shionogi Seiyaku研制出一種細(xì)菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍(lán)B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個(gè)月，關(guān)于其染色效果雖然有過一篇文獻(xiàn)評(píng)述，但卻沒有采用評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià)，很難判斷其染色效果。

4. 鍍銀染色法

1958年Rhodes根據(jù)Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細(xì)菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉淀，通過搖動(dòng)又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩(wěn)定10 min后使用。銀染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉淀剛好重新溶解，最后把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動(dòng)后呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩(wěn)定數(shù)周。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌后，再把銀染液滴加至涂片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。

由于Rhodes鍍銀染色法媒染液成分復(fù)雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細(xì)菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但試劑不穩(wěn)定，要求在4h內(nèi)使用，并用要用氨水調(diào)pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。

由于以上兩種鍍銀染色方法都要使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，并且需用無(wú)菌蒸餾水懸浮菌液制片，未采用評(píng)分法評(píng)價(jià)鍍銀染色方法。因此1977年，West等對(duì)鍍銀染色法進(jìn)一步改良，制備涂片時(shí)直接使用血平板，評(píng)價(jià)染色效果首次使用5分制，通過該評(píng)價(jià)方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，銀染液滴加至涂片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時(shí)West等還對(duì)使用不同培養(yǎng)基進(jìn)行染色效果評(píng)價(jià)，包括半固體動(dòng)力培養(yǎng)基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動(dòng)力培養(yǎng)基和TSA斜面25℃，培養(yǎng)18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養(yǎng)18～24h。評(píng)價(jià)結(jié)果血瓊脂平板35～37℃，培養(yǎng)18～24h不適于細(xì)菌鞭毛染色，而半固體動(dòng)力培養(yǎng)基和TSA斜面25℃，培養(yǎng)18～24h適合于細(xì)菌鞭毛染色，同時(shí)也證明了使用福爾馬林處理標(biāo)本制備涂片并不能有效阻止鞭毛脫落。

由于鍍銀染色法媒染液不穩(wěn)定，需避光5℃保存，1992年P(guān)orter等繼續(xù)改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可保存數(shù)月，延長(zhǎng)媒染劑染色時(shí)間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，制備涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養(yǎng)24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細(xì)菌（奇異變形桿菌）進(jìn)行研究。

于是1994年Finegan等進(jìn)一步證實(shí)使用過期媒染劑進(jìn)行鍍銀染色可以增強(qiáng)鞭毛染色效果，并使用4種細(xì)菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養(yǎng)24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周后進(jìn)行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細(xì)菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。

5、鞭毛的負(fù)染

具體操作：菌懸液，直接滴在銅網(wǎng)上，1－2分鐘后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鐘后，吸去多余的染液，然后就可以在電鏡下觀察了。一般染色后十五天之內(nèi)看電鏡。時(shí)間太長(zhǎng)效果不好。這是我試驗(yàn)用的方法。

曾做過一段時(shí)間的細(xì)菌鑒定，以下是一些染色心得：

首先染色用玻片一定要干凈，洗液泡過之后蒸餾水沖洗干凈。涂片的時(shí)候菌千萬(wàn)別涂得太多。第一部染色時(shí)，可將玻片置于水浴鍋內(nèi)，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的濕度，防止染色液變干不利于沖洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗干凈，否則影響染色效果，背景可能非常 臟。其他的步驟參考書上的資料進(jìn)行，一般沒什么問題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事項(xiàng)：

1. 要注意培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間：①用點(diǎn)接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個(gè)平板點(diǎn)接3～4處。經(jīng)比較用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的菌體活動(dòng)度大，鞭毛長(zhǎng)且多，易于染色，這可能與半固體培養(yǎng)基更適于菌體運(yùn)動(dòng)、鞭毛生長(zhǎng)較好有關(guān)。用點(diǎn)接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。②培養(yǎng)時(shí)間要嚴(yán)格掌握，一般培養(yǎng)9～12h較好，菌齡超過15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動(dòng)度降低、鞭毛易脫落有關(guān)。

2.染色過程中的細(xì)節(jié)也應(yīng)充分注意：①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環(huán)大幅度涂開；將載片稍傾斜，使菌液散開即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風(fēng)吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。④A染液染3～5 min，其后用蒸餾水（自來水效果差）沖洗時(shí)一定要充分，否則加B染液后，背景很臟，鞭毛不易被觀察到，影響實(shí)驗(yàn)效果。⑤加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果較不加熱為好。⑥B染液染完后，用蒸餾水沖洗比用自來水沖洗效果好。

本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌鞭毛染色的方法